Ученые доказали, что бинарный паттерн экспрессии в данных Smart-Seq является артефактом технологии

近日，中国农业大学植物保护学院彩万志/李虎/段元格团队在国际知名期刊《Nucleic Acids Research》（核酸研究）发表题为《A single-cell transcriptome atlas reveals paradoxical monoallelic expression of RNA editing and heterozygous SNPs》的研究论文。研究通过分析Smart-Seq转录组数据，发现在单个细胞层面，RNA编辑和杂合SNP位点都呈现“全有或全无”的二元表达模式（binary expression），只检测到一条等位基因。这暗示单细胞转录组数据在解析分子层面的多样性时，可能存在技术上的局限性，因此相关结果需要谨慎解读。本研究加深了对转录后修饰和基因组变异在多组学数据中表现形式的思考和理解。 故事的灵感来源于一个叫做“骨牌覆盖问题”（domino tiling problem）的思维实验：将一个8×8的棋盘去掉两个对角线上的格子，剩余部分能否用2×1的骨牌完全覆盖（图1）？ 图1.骨牌覆盖问题示意图 实验科学的逻辑是通过做实验去穷举，穷举之后自然能回答是或否。但实际上，这个问题有一种更简单的“逻辑解法”：设想原本棋盘有32白格+ 32黑格，去掉2白后（若去掉2黑也是同理），剩下32黑+ 30白。因为每块骨牌覆盖1白+ 1黑，所以如果要全部铺完，棋盘上白格和黑格数量必须一样，但实际情况不一样，推导出矛盾。所以答案是不可能，而且这个结论并不会因为棋盘的颜色分布变化而改变。这个趣味实验体现了纯粹的逻辑推导在实验学科中的应用。 ADAR（腺苷脱氨酶）介导的腺嘌呤到次黄嘌呤（A-to-I）RNA编辑是细胞中普遍存在的RNA修饰，在RNA水平引入A-to-G的变异，从而增加转录组和蛋白组多样性。但RNA编辑效率并不是100%：在bulk RNA-Seq中，整体上的编辑水平（中位数）通常在10~20%左右。有趣的是，先前有外国团队分析了人类大脑Smart-Seq单细胞转录组，发现虽然在bulk水平（组织水平）的RNA编辑呈现出“部分编辑”的模式，能检测到A和G两种等位基因；但在单细胞水平，在ADAR有表达的情况下，RNA编辑竟然是“全有或全无”的二元表达模式：给定一个编辑位点，一个细胞要么完全不编辑，只有A被测到；要么100%编辑，只有G被测到（图2A）。 图2.位点表达模式在bulk水平与单细胞水平的对比 在本研究中，受到“骨牌覆盖问题”的启发，我们首先从逻辑上推导出RNA编辑的单细胞二元表达模式几乎是不可能的（图3A-D）：首先，机制不明。ADAR的编辑是共转录发生的，那么为什么有的细胞中ADAR完全忽视了所有新生mRNA，而有的细胞中ADAR却不放过任何一条新生mRNA（图3B）？第二，高温使得ADAR的底物dsRNA变得不稳定，从而在bulk水平会展现出编辑水平下降，这个事实是由酶促反应的概率本质决定的。但如果考虑单细胞二元表达模式，生化反应的概率本质将被颠覆（图3C）。第三，在禾谷镰刀菌中，RNA编辑被证实具有杂合子优势，这种杂合子优势理应是对单个细胞的真菌成立的。但放到二元表达模式下，这种杂合子优势将不复存在（图3D）。综上，我们从逻辑上推测出RNA编辑的单细胞二元表达模式可能并没有反应生物体内真实的情况，而可能是来自检测技术层面的某些局限。 图3. RNA编辑的单细胞二元表达模式引起的逻辑矛盾 为了探究单细胞二元表达模式是否普遍存在，我们从Fly Cell Atlas下载了w1118果蝇全身Smart-Seq单细胞转录组图谱，共获得超过13000个细胞（文库）。我们发现94%的RNA编辑位点确实呈现二元表达模式（图2A），呼应了前人在人脑细胞中的结果。令人意外的是，我们发现93%的杂合SNP位点在Smart-Seq数据中也呈现二元表达模式，这些SNP位点只表达两条等位基因里的一条（图2B）。 例如，在X染色体上的三个杂合SNP位点，完全连锁形成两种单倍型（图4）。在混合个体的DNA重测序中，两种单倍型都能检测到（图4A）；对大量的单只w1118果蝇个体进行DNA Sanger测序，验证了两种单倍型的纯合个体以及杂合个体都存在（图4B），说明基因型推断准确。但在来自同一个雌性杂合个体的不同Smart-Seq单细胞转录组中，每个细胞只随机检测到其中一种单倍型（图4）。由于果蝇不存在哺乳动物中的X染色体随机失活现象，所以我们观察到的Smart-Seq的二元表达模式很可能是来自技术层面的局限性如扩增偏差等，而并不能反映生物体内的实际情况。这也说明Smart-Seq可能不适合用于研究SNP或RNA编辑产生的分子多样性。 图4.杂合SNP位点在单细胞水平也展现出二元表达模式 三位审稿人对本文给予了高度评价。其中一位审稿人评论：“作者通过精妙的逻辑推理，在不依赖实验分析的情况下就证伪了RNA编辑二元表达的假说。这太美妙了，这种逻辑思考展现出了科学研究最纯粹的美。” 中国农业大学段元格副教授、博士生刘霁瑶、已毕业博士生徐士雯（现陕西理工大学讲师）为共同第一作者，李虎教授为共同通讯作者。彩万志教授、宋凡副教授、田里副教授、博士生谢秋骅等也参与该工作。杜娟教授、刘晨曦副教授为本工作提供了部分研究材料。该研究得到中央高校基本科研业务费专项资金、中国农业大学2115人才培育发展计划等项目的支持。 供稿：植保学院 供图：植保学院 编辑：马文哲 责编：武慧媛